COVID-19 एंटीबॉडी परीक्षण और एलिसा (भाग 2)

हमारे पिछले ब्लॉग में, कोविड-19 एंटीबॉडी परीक्षण और एलिसा (भाग 1), हमने कोविड एंटीबॉडी परीक्षण के लाभों और क्यों एलिसा उसी के लिए एक पसंदीदा तरीका है, इस पर चर्चा की। भाग 2 (यह बहुत ही वैज्ञानिक है!) में, हम एलिसा प्रक्रिया, व्याख्या और सीमाओं के चरणों के बारे में जानेंगे।

एलिसा प्रक्रिया :

एलिसा में छह मुख्य चरण होते हैं - एंटीबॉडी कोटिंग, प्रोटीन कैप्चर, डिटेक्शन एंटीबॉडी, एंजाइम कंजुगेट, सब्सट्रेट का जोड़ और विश्लेषण।

1. एंटीबॉडी कोटिंग: विशिष्ट एंटीबॉडी को 96-कुओं वाली एलिसा प्लेट में जोड़ा जाता है और रात भर ऊष्मायन (4°C) द्वारा उच्च-प्रोटीन बाइंडिंग प्लेटों पर स्थिर किया जाता है।
2. प्रोटीन कैप्चर: मानक तनुकरण समाधानों को कुओं में धोने की एक निश्चित श्रृंखला के बाद (कुओं से गैर-विशिष्ट बाइंडिंग प्रोटीन को धोने के बाद) जोड़ा जाता है और बंधे एंटीबॉडी को कैप्चर किया जाता है।
3. डिटेक्शन एंटीबॉडी: कैप्चर किए गए प्रोटीन का पता लगाने के लिए डिटेक्शन एंटीबॉडी को पतला करने के लिए विशिष्ट तनुकरण बफर जोड़े जाते हैं।
4. एंजाइम कंजुगेट: एंजाइम-लेबल वाले सेकेंडरी एंटीबॉडी को कुओं में एंजाइम-लेबल वाले सेकेंडरी एंटीबॉडी को सैंपल तनुकरण बफर के साथ पतला करने की एक श्रृंखला के बाद जोड़ा जाता है और सेकेंडरी एंटीबॉडी को प्राथमिक एंटीबॉडी से बांधने के लिए 37℃ पर 1 घंटे के लिए ऊष्मायन के लिए छोड़ दिया जाता है।
5. सब्सट्रेट का जोड़: धोने की एक श्रृंखला के माध्यम से सेकेंडरी एंटीबॉडी को हटाने के बाद, रंगीन सब्सट्रेट को कुओं में जोड़ा जाता है ताकि एंजाइमों द्वारा उत्प्रेरित होने पर कुओं में रंगीन समाधान प्राप्त हो सके।
6. विश्लेषण: अवशोषण को एलिसा रीडर में 450nm पर मापा जाता है।

लिपोप्रोटीन (एंटीजन) – लक्षित एंटीबॉडी बाइंडिंग के आधार पर, परख चार प्रकार की हो सकती है - डायरेक्ट एलिसा, इनडायरेक्ट एलिसा, सैंडविच, कॉम्पिटिटिव एलिसा।

1. डायरेक्ट एलिसा: लक्षित प्रोटीन को माइक्रोटिटर प्लेट की सतह पर स्थिर किया जाता है और एंजाइम लेबल वाले लक्षित एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन किया जाता है, और एंजाइम कंजुगेट द्वारा पहचाना जाता है जो सब्सट्रेट प्रतिक्रियाओं के बाद पता लगाने की अनुमति देता है।
2. इनडायरेक्ट एलिसा: लक्षित प्रोटीन को प्लेट की सतह पर स्थिर किया जाता है और लक्षित एंटीबॉडी (प्राथमिक एंटीबॉडी) के साथ ऊष्मायन किया जाता है, जिसके बाद सेकेंडरी एंटीबॉडी प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ संयुग्मित होता है, गतिविधि को फिर सब्सट्रेट प्रतिक्रिया के बाद प्लेट पर मापा जाता है। लेबल वाले सेकेंडरी एंटीबॉडी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं।
3. सैंडविच एलिसा: एंटीजन पर दो अलग-अलग एपिटोप्स के लिए विशिष्ट दो एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है। एक एंटीबॉडी (प्राथमिक एंटीबॉडी) को लक्षित प्रोटीन (एंटीजन) के साथ पहले प्लेट की सतह पर स्थिर किया जाता है, और एंटीजन पर विभिन्न एपिटोप्स पर एक और लक्षित विशिष्ट एंटीबॉडी (सेकेंडरी एंटीबॉडी) के साथ। सब्सट्रेट प्रतिक्रिया के बाद गतिविधि को मापा जा सकता है।
4. कॉम्पिटिटिव एलिसा: लक्षित एंटीजन (संदर्भ एंटीजन) के लिए विशिष्ट एक एंटीबॉडी को माइक्रोटिटर प्लेट की सतह पर स्थिर किया जाता है, और लक्षित प्रोटीन युक्त नमूने (अवरोधक एंटीजन) के साथ ऊष्मायन किया जाता है, यह प्राथमिक एंटीबॉडी से बंधन के लिए संदर्भ एंटीजन के साथ प्रतिस्पर्धा करता है। अनबाउंड सामग्री को धो दिया जाता है, नमूने में जितना अधिक एंटीजन होगा, कोटेड एंटीजन से उतना ही कम विशिष्ट एंटीबॉडी बंधेगा, कुओं में समाधान का रंग उतना ही हल्का होगा और अंतिम संकेत उतना ही कम होगा। इसके विपरीत, जब नमूने में एंटीजन कम होता है, तो एंटीबॉडी-बाउंड एंजाइम-लेबल वाले एंटीजन का स्तर अधिक होता है, कुओं में समाधान का रंग गहरा होता है और अंतिम एकाग्रता अधिक होती है।

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आईजी एलिसा:

एलिसा सभी आइसोोटाइप और विशिष्टताओं के इम्युनोग्लोबुलिन के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक उपयोगी और उपयुक्त विधि है। आइसोोटाइप-विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके, नमूनों में IgG, IgA, IgM, और IgE (प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं के दौरान रक्त में जारी) की मात्रा को निर्धारित किया जा सकता है।

इम्युनोग्लोबुलिन के आइसोोटाइप-निर्धारक क्षेत्रों के लिए विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का विकास पता लगाने की विशिष्टता को बढ़ाने में मदद करता है। एक सैंडविच एलिसा विधि का उपयोग किया जा सकता है, जिसमें प्लेट को एंटीबॉडी के साथ लेपित किया गया है जो इम्युनोग्लोबुलिन को पकड़ता है और इम्युनोग्लोबुलिन की कुल मात्रा (एंटीजन विशिष्टता के बावजूद) भी निर्धारित करता है। ये एंटीजन-विशिष्ट इम्युनोग्लोबुलिन लेपित एंटीजन से बंधते हैं और बायोटिन लेबल वाले एंटीबॉडी का उपयोग करके पता लगाया जा सकता है।

एंजाइम से सीधे संयुग्मित एंटीबॉडी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, जो नमूनों में IgG, IgA, या IgM के कुल स्तरों को निर्धारित करते हैं। कुल IgE के माप के लिए, बढ़ी हुई संवेदनशीलता के लिए स्ट्रेप्टाविडिन-एंजाइम संयुग्म के संयोजन में बायोटिन लेबल वाले डिटेक्शन एंटीबॉडी के उपयोग की सिफारिश की जाती है।

IgM एलिसा के समानांतर IgG एलिसा का उपयोग करके, दिए गए नमूने में एंटीबॉडी में सापेक्ष भिन्नता देखी जा सकती है। IgG-एलिसा इम्यूनोफ्लोरेसेंस के प्रति कम संवेदनशील है और एक समय में बड़ी संख्या में नमूनों को संसाधित किया जा सकता है।

कोविड-19 के लिए IgG एलिसा परीक्षण:

यह परीक्षण व्यक्तियों से एकत्र किए गए प्लाज्मा या सीरम नमूनों का उपयोग करके IgG एंटीबॉडी (संक्रमण के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के हिस्से के रूप में उत्पादित) को मापता है। IgG ठोस-चरण एलिसा को मिलान एंटीबॉडी जोड़ी से बंधे लक्षित प्रोटीन की मात्रा को मापने के लिए डिज़ाइन किया गया है। लक्षित विशिष्ट एंटीबॉडी को पहले से लेपित किया जाता है, नमूनों, मानकों और नियंत्रणों को एंटीबॉडी के स्थिरीकरण (कैप्चर) के लिए कुओं में जोड़ा जाता है।

शामिल संभावित लाभ और जोखिम:

परीक्षण से जुड़े कुछ लाभ और जोखिम हैं। मुख्य लाभों में से एक यह है कि परीक्षण परिणाम यह दर्शाता है कि कोई व्यक्ति वायरस से संक्रमित है या नहीं, जिससे बीमारी के प्रसार को सीमित किया जा सकता है। परीक्षण से यह भी लाभ होता है कि यह उन संक्रमित लोगों की पहचान करने में मदद करता है जो लक्षणहीन हैं। यह परीक्षण स्वास्थ्य सेवा कार्यकर्ता - डॉक्टर, नर्स आदि - को लाभ पहुंचा सकता है, यह परीक्षण आपके स्वास्थ्य सेवा प्रदाता को आपकी स्वास्थ्य स्थितियों के बारे में सूचित करने और संभावित सिफारिशें देने में भी मदद कर सकता है।

परीक्षण से जुड़े संभावित जोखिम हैं - आपको संभावित असुविधा या चोट लग सकती है, संक्रमण या कोई अन्य जटिलताएं जो नमूना संग्रह के दौरान या बाद में हो सकती हैं। गंभीर जटिलताएं बहुत कम देखी जाती हैं। परीक्षण गलत परिणाम भी दिखा सकता है।

सकारात्मक परीक्षण परिणाम का क्या अर्थ है?

कोविड एलिसा IgG एंटीबॉडी परीक्षण के लिए सकारात्मक परिणाम नमूने में IgG एंटीबॉडी की उपस्थिति को इंगित करता है और व्यक्ति वायरस के संपर्क में आया था। IgG एंटीबॉडी की उपस्थिति एक पिछले संक्रमण को इंगित करती है। IgG एंटीबॉडी संक्रमण के बाद IgM एंटीबॉडी की तुलना में बाद में विकसित होते हैं, और आम तौर पर संक्रमण के 7 - 10 दिनों तक दिखाई नहीं देते हैं। यह अभी भी अज्ञात है कि संक्रमण के बाद IgG एंटीबॉडी शरीर में कितने समय तक रहेंगे और क्या वे संक्रमण से प्रतिरक्षा प्रदान करते हैं।

अभी भी ऐसी संभावनाएं हैं कि शरीर में विकसित ये एंटीबॉडी अन्य वायरस/बैक्टीरिया आदि के कारण पिछले संक्रमण को इंगित करते हैं। अंतिम निदान करने और रोगी प्रबंधन निर्णयों में भी नैदानिक ​​अवलोकनों और महामारी विज्ञान डेटा के संदर्भ में प्रयोगशाला परीक्षण परिणामों पर हमेशा विचार किया जाना चाहिए। ऐसी भी संभावनाएं हैं कि परीक्षण परिणाम गलत हैं (गलत सकारात्मक)। हालांकि, गलत सकारात्मक परिणाम की स्थिति में, एक व्यक्ति के लिए जोखिम में सक्रिय कोविड-19 वाले व्यक्तियों के संपर्क में आने से संक्रमण का जोखिम शामिल हो सकता है।

नकारात्मक परिणाम का क्या अर्थ है?

कोविड एलिसा IgG एंटीबॉडी परीक्षण के लिए नकारात्मक परीक्षण परिणाम इंगित करते हैं कि एकत्र किए गए नमूने में विशिष्ट एंटीबॉडी मौजूद नहीं थे। हालांकि, नकारात्मक परीक्षण परिणाम पिछले कोविड-19 को बाहर नहीं करते हैं। परीक्षण परिणामों का उपयोग उपचार, रोगी प्रबंधन निर्णयों या सक्रिय संक्रमण को बाहर करने के लिए एकमात्र आधार के रूप में नहीं किया जाना चाहिए क्योंकि संक्रमण के शुरुआती चरणों के दौरान परीक्षण किए गए कुछ रोगियों में सक्रिय संक्रमण के बावजूद IgG एंटीबॉडी विकसित नहीं हो सकते हैं और सभी व्यक्तियों में पता लगाने योग्य IgG प्रतिक्रिया विकसित नहीं होती है।

गलत नकारात्मक परिणामों की संभावना पर रोगी के हालिया एक्सपोजर और नैदानिक ​​संकेतों और लक्षणों की उपस्थिति के संदर्भ में विचार किया जाना चाहिए।

संदर्भ

• https://pib.gov.in/PressReleasePage.aspx?PRID=1622766
• https://timesofindia.indiatimes.com/gadgets-news/pune-lab-develops-made-in-india-covid-19-kit-that-can-test-90-samples-in-2-5-hours/articleshow/75668541.cms
• https://www.fda.gov/media/136151/download
• https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/symptoms-testing/testing.html
• https://www.fda.gov/media/137030/download