మా మునుపటి బ్లాగులో, COVID-19 యాంటీబాడీ టెస్టింగ్ అండ్ ELISA (పార్ట్ 1), మేము COVID యాంటీబాడీ టెస్టింగ్ ప్రయోజనాలను మరియు ELISA ఎందుకు ఇష్టపడే పద్ధతి అని చర్చించాము. పార్ట్ 2లో (ఇది చాలా సైన్స్-వై!), మేము ELISA విధానం, వివరణ మరియు పరిమితులలోని దశల గురించి తెలుసుకుంటాము.
ELISA విధానం:
ELISAలో ఆరు ప్రధాన దశలు ఉన్నాయి – యాంటీబాడీ పూత, ప్రోటీన్ క్యాప్చర్, డిటెక్షన్ యాంటీబాడీ, ఎంజైమ్ సంయోగం, సబ్స్ట్రేట్ అదనంగా మరియు విశ్లేషణ.
- యాంటీబాడీ పూత: నిర్దిష్ట యాంటీబాడీలు 96-బావుల ELISA ప్లేట్లోకి చేర్చబడతాయి మరియు రాత్రిపూట ఇంక్యుబేషన్ (4°C) ద్వారా అధిక-ప్రోటీన్ బైండింగ్ ప్లేట్లపై స్థిరీకరించబడతాయి.
- ప్రోటీన్ క్యాప్చర్: నిర్దిష్ట శ్రేణి వాష్ తర్వాత (నాన్-నిర్దిష్ట బైండింగ్ ప్రోటీన్లను బావుల నుండి కడిగిన తర్వాత) బావులకు ప్రామాణిక సజల ద్రావణాలు చేర్చబడతాయి మరియు బంధన యాంటీబాడీలను పట్టుకుంటాయి.
- డిటెక్షన్ యాంటీబాడీలు: పట్టుకున్న ప్రోటీన్లను గుర్తించడానికి డిటెక్షన్ యాంటీబాడీలను పలుచన చేయడానికి నిర్దిష్ట పలుచన బఫర్లు చేర్చబడతాయి.
- ఎంజైమ్ సంయోగం: ఎంజైమ్-లేబుల్ చేయబడిన ద్వితీయ యాంటీబాడీలు బావులకు చేర్చబడతాయి, ఎంజైమ్-లేబుల్ చేయబడిన ద్వితీయ యాంటీబాడీలను నమూనా పలుచన బఫర్తో వరుసగా పలుచన చేసిన తర్వాత మరియు ప్రాధమిక యాంటీబాడీకి ద్వితీయ యాంటీబాడీల బంధనానికి 37℃ వద్ద 1 గంట ఇంక్యుబేషన్ కోసం వదిలివేయబడతాయి.
- సబ్స్ట్రేట్ అదనంగా: వరుసగా కడగడం ద్వారా ద్వితీయ యాంటీబాడీలను తొలగించిన తర్వాత, ఎంజైమ్లచే ఉత్ప్రేరితమైనప్పుడు బావులలో రంగు ద్రావణం పొందడానికి బావులకు కలరిమెట్రిక్ సబ్స్ట్రేట్ చేర్చబడుతుంది.
- విశ్లేషణ: 450nm వద్ద ELISA రీడర్లో శోషణ కొలవబడుతుంది.
లిపోప్రోటీన్ (యాంటిజెన్) – టార్గెట్ యాంటీబాడీ బైండింగ్ ఆధారంగా, పరీక్ష నాలుగు రకాలుగా ఉంటుంది – డైరెక్ట్ ELISA, ఇన్డైరెక్ట్ ELISA, శాండ్విచ్, కాంపిటీటివ్ ELISA.
- డైరెక్ట్ ELISA: టార్గెట్ ప్రోటీన్ మైక్రోటైటర్ ప్లేట్ ఉపరితలంపై స్థిరీకరించబడుతుంది మరియు ఎంజైమ్ లేబుల్ చేయబడిన టార్గెట్ యాంటీబాడీతో ఇంక్యుబేట్ చేయబడుతుంది మరియు సబ్స్ట్రేట్ ప్రతిచర్యల తర్వాత గుర్తింపును అనుమతించే ఎంజైమ్ కాంజుగేట్ ద్వారా గుర్తించబడుతుంది.
- ఇన్డైరెక్ట్ ELISA: టార్గెట్ ప్రోటీన్ ప్లేట్ ఉపరితలంపై స్థిరీకరించబడుతుంది మరియు టార్గెట్ యాంటీబాడీలతో (ప్రాధమిక యాంటీబాడీ) ఇంక్యుబేట్ చేయబడుతుంది, తర్వాత ప్రాధమిక యాంటీబాడీతో సంయోగం చెందే ద్వితీయ యాంటీబాడీ, సబ్స్ట్రేట్ ప్రతిచర్య తర్వాత ప్లేట్పై కార్యాచరణ కొలవబడుతుంది. లేబుల్ చేయబడిన ద్వితీయ యాంటీబాడీలు వాణిజ్యపరంగా అందుబాటులో ఉన్నాయి.
- శాండ్విచ్ ELISA: యాంటిజెన్లపై రెండు విభిన్న ఎపిటోప్లకు నిర్దిష్టమైన రెండు యాంటీబాడీలు ఉపయోగించబడతాయి. ఒక యాంటీబాడీ (ప్రాధమిక యాంటీబాడీ) మొదట ప్లేట్ ఉపరితలంపై టార్గెట్ ప్రోటీన్ (యాంటిజెన్)తో స్థిరీకరించబడుతుంది మరియు యాంటిజెన్పై విభిన్న ఎపిటోప్ల వద్ద మరొక టార్గెట్ నిర్దిష్ట యాంటీబాడీ (ద్వితీయ యాంటీబాడీ)కి. సబ్స్ట్రేట్ ప్రతిచర్య తర్వాత కార్యాచరణను కొలవవచ్చు.
- కాంపిటీటివ్ ELISA: టార్గెట్ యాంటిజెన్ (రిఫరెన్స్ యాంటిజెన్)కి నిర్దిష్టమైన ఒక యాంటీబాడీ మైక్రోటైటర్ ప్లేట్ ఉపరితలంపై స్థిరీకరించబడుతుంది మరియు టార్గెట్ ప్రోటీన్లను కలిగి ఉన్న నమూనాతో (ఇన్హిబిటర్ యాంటిజెన్) ఇంక్యుబేట్ చేయబడుతుంది, ఇది ప్రాధమిక యాంటీబాడీకి బంధనం కోసం రిఫరెన్స్ యాంటిజెన్తో పోటీపడుతుంది. బంధనం లేని పదార్థాలు కడిగివేయబడతాయి, నమూనాలో ఎక్కువ యాంటిజెన్ ఉంటే, కోటెడ్ యాంటిజెన్కు బంధనమైన తక్కువ నిర్దిష్ట యాంటీబాడీ, బావులలో ద్రావణం యొక్క రంగు తేలికగా ఉంటుంది మరియు తుది సంకేతం తక్కువగా ఉంటుంది. దీనికి విరుద్ధంగా, నమూనాలో యాంటిజెన్ తక్కువగా ఉన్నప్పుడు, యాంటీబాడీ-బంధన ఎంజైమ్-లేబుల్ చేయబడిన యాంటిజెన్ స్థాయి ఎక్కువగా ఉంటుంది, బావులలో ద్రావణం యొక్క రంగు ముదురుతుంది మరియు తుది గాఢత ఎక్కువగా ఉంటుంది.
ఇది కూడా చదవండి: COVID-19 యాంటీబాడీ టెస్టింగ్ మరియు ELISA (పార్ట్ 1)
Ig ELISA :
ELISA అనేది అన్ని ఐసోటైప్లు మరియు నిర్దిష్టతలకు ఇమ్యునోగ్లోబులిన్లను గుర్తించడానికి ఉపయోగకరమైన మరియు అనుకూలమైన పద్ధతి. ఐసోటైప్-నిర్దిష్ట యాంటీబాడీలను ఉపయోగించి, నమూనాలలో IgG, IgA, IgM మరియు IgE (రోగనిరోధక ప్రతిచర్యల సమయంలో రక్తంలో విడుదలయ్యేవి) మొత్తాలను గుర్తించవచ్చు.
ఇమ్యునోగ్లోబులిన్ల ఐసోటైప్-నిర్ధారణ ప్రాంతాలకు నిర్దిష్టమైన మోనోక్లోనల్ యాంటీబాడీల అభివృద్ధి గుర్తింపు యొక్క నిర్దిష్టతను పెంచడానికి సహాయపడుతుంది. ఒక శాండ్విచ్ ELISA పద్ధతిని ఉపయోగించవచ్చు, ఇందులో ప్లేట్ ఇమ్యునోగ్లోబులిన్లను బంధించే యాంటీబాడీతో పూత పూయబడి ఉంటుంది మరియు ఇమ్యునోగ్లోబులిన్ల మొత్తం మొత్తాన్ని కూడా నిర్ణయిస్తుంది (యాంటిజెన్ నిర్దిష్టతతో సంబంధం లేకుండా). ఈ యాంటిజెన్-నిర్దిష్ట ఇమ్యునోగ్లోబులిన్లు పూత పూయబడిన యాంటిజెన్కు బంధించబడతాయి మరియు బయోటిన్ లేబుల్ చేయబడిన యాంటీబాడీలను ఉపయోగించి గుర్తించవచ్చు.
ఎంజైమ్కు నేరుగా సంయోగం చేయబడిన యాంటీబాడీలు వాణిజ్యపరంగా అందుబాటులో ఉన్నాయి, ఇవి నమూనాలలో IgG, IgA లేదా IgM యొక్క మొత్తం స్థాయిలను నిర్ణయిస్తాయి. మొత్తం IgE కొలత కోసం, స్ట్రెప్టావిడిన్-ఎంజైమ్ కాంజుగేట్తో కలిపి బయోటిన్ లేబుల్ చేయబడిన గుర్తింపు యాంటీబాడీని ఉపయోగించడం పెరిగిన సున్నితత్వం కోసం సిఫార్సు చేయబడింది.
IgM ELISAతో సమాంతరంగా IgG ELISAని ఉపయోగించడం ద్వారా, ఇచ్చిన నమూనాలో యాంటీబాడీలలో సంబంధిత వైవిధ్యాలను గమనించవచ్చు. IgG-ELISA ఇమ్యునోఫ్లోరెసెన్స్ కంటే తక్కువ ఆత్మాశ్రయం మరియు ఒకేసారి పెద్ద సంఖ్యలో నమూనాలను ప్రాసెస్ చేయవచ్చు.
COVID-19 కోసం IgG ELISA పరీక్ష:
ఈ పరీక్ష వ్యక్తుల నుండి సేకరించిన ప్లాస్మా లేదా సీరం నమూనాలను ఉపయోగించి IgG యాంటీబాడీలను (సంక్రమణకు రోగనిరోధక ప్రతిస్పందనలో భాగంగా ఉత్పత్తి చేయబడినవి) కొలుస్తుంది. IgG సాలిడ్-ఫేజ్ ELISA మ్యాచ్డ్ యాంటీబాడీ జతకు బంధించబడిన టార్గెట్ ప్రోటీన్ల మొత్తాన్ని కొలవడానికి రూపొందించబడింది. టార్గెట్ నిర్దిష్ట యాంటీబాడీ ముందుగా పూత పూయబడుతుంది, యాంటీబాడీలను స్థిరీకరించడానికి (బంధనం) బావులకు నమూనాలు, ప్రమాణాలు మరియు నియంత్రణలు చేర్చబడతాయి.
సంభావ్య ప్రయోజనాలు మరియు నష్టాలు:
పరీక్షతో కొన్ని ప్రయోజనాలు మరియు నష్టాలు ముడిపడి ఉన్నాయి. ప్రధాన ప్రయోజనాలలో ఒకటి ఏమిటంటే, పరీక్ష ఫలితాలు ఒక వ్యక్తికి వైరస్ సోకిందా లేదా అని చూపిస్తాయి, తద్వారా వ్యాధి వ్యాప్తిని పరిమితం చేస్తుంది. పరీక్ష అసింప్టమాటిక్ అయిన సోకిన వ్యక్తులను గుర్తించడానికి కూడా సహాయపడుతుంది. ఈ పరీక్ష ఆరోగ్య సంరక్షణ కార్యకర్తలకు – వైద్యులు, నర్సులు మొదలైనవారికి ప్రయోజనం చేకూరుస్తుంది, పరీక్ష మీ ఆరోగ్య సంరక్షణ ప్రదాతకు కూడా సహాయపడుతుంది, మీ ఆరోగ్య పరిస్థితుల గురించి మీకు తెలియజేస్తుంది మరియు సాధ్యమయ్యే సిఫార్సులను అందిస్తుంది.
పరీక్షతో ముడిపడి ఉన్న సంభావ్య నష్టాలు – నమూనా సేకరణ సమయంలో లేదా తర్వాత సంభవించే అసౌకర్యం లేదా గాయాలు, సంక్రమణ లేదా ఇతర సమస్యలు మీకు ఉండవచ్చు. తీవ్రమైన సమస్యలు చాలా అరుదుగా కనిపిస్తాయి. పరీక్ష తప్పుడు ఫలితాలను కూడా చూపవచ్చు.
పాజిటివ్ పరీక్ష ఫలితం అంటే ఏమిటి?
COVID ELISA IgG యాంటీబాడీ పరీక్షకు పాజిటివ్ ఫలితం నమూనాలో IgG యాంటీబాడీల ఉనికిని సూచిస్తుంది మరియు వ్యక్తి వైరస్కు గురయ్యాడు. IgG యాంటీబాడీల ఉనికి గత సంక్రమణను సూచిస్తుంది. IgG యాంటీబాడీలు సంక్రమణ తర్వాత IgM యాంటీబాడీల కంటే ఆలస్యంగా అభివృద్ధి చెందుతాయి మరియు సాధారణంగా సంక్రమణ తర్వాత 7 – 10 రోజుల వరకు కనిపించవు. సంక్రమణ తర్వాత IgG యాంటీబాడీలు శరీరంలో ఎంతకాలం ఉంటాయి మరియు అవి సంక్రమణకు రోగనిరోధక శక్తిని ఇస్తాయా అనేది ఇంకా తెలియదు.
శరీరంలో అభివృద్ధి చెందిన ఈ యాంటీబాడీలు ఇతర వైరస్లు/బ్యాక్టీరియా మొదలైన వాటి వల్ల గత సంక్రమణను సూచించే అవకాశాలు ఇంకా ఉన్నాయి. తుది నిర్ధారణ చేయడానికి మరియు రోగి నిర్వహణ నిర్ణయాలలో క్లినికల్ పరిశీలనలు మరియు ఎపిడెమియోలాజికల్ డేటా సందర్భంలో ప్రయోగశాల పరీక్ష ఫలితాలను ఎల్లప్పుడూ పరిగణించాలి. పరీక్ష ఫలితాలు తప్పుగా ఉండే అవకాశాలు కూడా ఉన్నాయి (తప్పుడు పాజిటివ్). అయితే, తప్పుడు పాజిటివ్ ఫలితం వచ్చిన సందర్భంలో, ఒక వ్యక్తికి ప్రమాదాలు సక్రియాత్మక COVID-19 ఉన్న వ్యక్తులకు గురికావడం వల్ల సంక్రమణ ప్రమాదాన్ని కలిగి ఉండవచ్చు.
నెగటివ్ ఫలితం అంటే ఏమిటి?
COVID ELISA IgG యాంటీబాడీ పరీక్షకు నెగటివ్ పరీక్ష ఫలితాలు సేకరించిన నమూనాలో నిర్దిష్ట యాంటీబాడీలు లేవని సూచిస్తుంది. అయితే, నెగటివ్ పరీక్ష ఫలితాలు మునుపటి COVID-19ని మినహాయించవు. చికిత్స, రోగి నిర్వహణ నిర్ణయాలకు లేదా సక్రియాత్మక సంక్రమణను మినహాయించడానికి పరీక్ష ఫలితాలను ఏకైక ఆధారంగా ఉపయోగించకూడదు ఎందుకంటే సంక్రమణ ప్రారంభ దశలలో పరీక్షించిన కొంతమంది రోగులు సక్రియాత్మక సంక్రమణ ఉన్నప్పటికీ IgG యాంటీబాడీలను అభివృద్ధి చేయకపోవచ్చు మరియు అన్ని వ్యక్తులు గుర్తించదగిన IgG ప్రతిస్పందనను అభివృద్ధి చేయరు.
తప్పుడు నెగటివ్ ఫలితాల సంభావ్యతను రోగి యొక్క ఇటీవలి బహిర్గతం మరియు క్లినికల్ సంకేతాలు మరియు లక్షణాల ఉనికి సందర్భంలో పరిగణించాలి.
రిఫరెన్స్లు
- https://pib.gov.in/PressReleasePage.aspx?PRID=1622766
- https://timesofindia.indiatimes.com/gadgets-news/pune-lab-develops-made-in-india-covid-19-kit-that-can-test-90-samples-in-2-5-hours/articleshow/75668541.cms
- https://www.fda.gov/media/136151/download
- https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/symptoms-testing/testing.html
- https://www.fda.gov/media/137030/download
